CRISPR-Cas9应用——基因敲除与敲入系统 嘌呤霉素筛选

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一、筛选获得的敲除细胞株，后续做其他检测时还要加嘌呤霉素吗

二、CRISPR-Cas9应用——基因敲除与敲入系统

一、筛选获得的敲除细胞株，后续做其他检测时还要加嘌呤霉素吗

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二、CRISPR-Cas9应用——基因敲除与敲入系统

实验流程：1。设计sgRNA 2。构建sgRNA-Cas9载体3。构建sgRNA-Cas9稳定转化菌株4。筛选细胞克隆并进行qPCR验证5。测序阳性克隆并选择纯合细胞株来敲除6。筛选细胞单克隆测序实验步骤1、设计小鼠LIF基因座的sgRNA(NM _ 008501)。进行软件分析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。

2、构建sgRNA-Cas9载体，然后将选择的sgRNA设计克隆到Plenti-U6-SG RNA-SFFv-cas 9-2A-puro all-in-one lenti vector(图1)3、构建sgRNA-Cas9稳定的转基因植物使用慢病毒包装系统构建sgRNA-Cas9稳定的转基因植物。

提取基因组DNA并验证以确定目标基因座是否被编辑。野生型(WT)分析中的单一条带表明没有发生编辑。两个较小的带(总和WT的长度)指示编辑已经发生。图2显示克隆3和6被编辑；克隆2未被编辑；克隆1不确定。5、阳性克隆测序，选择突变细胞系，通过Sanger测序进一步分析细胞集落3和6的PCR产物，以确定敲除特性(图3)。

对于细胞集落3，仅检测到一个突变序列，表明这些细胞可能只是杂合敲除的。在菌落6中检测到两种不同的突变序列。6、筛选细胞选择将单克隆纯合突变细胞系集落6连续稀释到96孔板中用于单克隆选择。从这些克隆中提取基因组DNA(6a，6b.)，并进行PCR扩增、克隆和测序。

测序显示，在两个等位基因中，只有克隆6a具有移码突变(图4)。移码突变破坏开放阅读框架，导致无意义介导的mRNA。

7、进一步测序确定纯合突变的实验原理：CRISPR-Cas9基因的敲入系统是Cas9内切酶切割双链DNA，存在高度同源的DNA修复模板，在体内启动HDR修复路径，将外源DNA定点插入基因中。同源定向修复(HDR)途径是比NHEJ修复途径更精确的修复机制。

这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。在这个修复途径中，需要将与预期编辑位点的上下游相邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异性gRNA和Cas9核酸酶引入细胞。在高度同源的DNA模板存在下，HDR机制可以通过同源重组将一段DNA插入编辑位点(图4)。这种修复方法可以准确地将DNA序列插入特定的基因组位点。

实验流程：1。设计sgRNA-Cas9，修复DNA模板2。构建sgRNA-Cas9质粒，修复DNA模板3。将sgRNA-Cas9、修复DNA模板转移到293T细胞4。嘌呤筛选和荧光检测。PCR检测基因组，RFP蛋白是否被敲入实验步骤：1 .设计sgRNA，修复DNA模板。设计用于软件分析的人类AAVS1 AAVS1安全港基因的sgRNA，以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。

设计一个DNA修复模板，两边都是同源臂，两边都是600bp的同源臂。2 sgRNA质粒和DNA模板质粒的构建将选定的sgRNA设计和CMV启动子驱动的Cas9基因克隆到pCas-Guide中，制备pCas-Guide-AAVS1。将DNA修复模板插入到含有RFP-嘌呤霉素的PAA VS 1-RFP- DNR表达载体中。3 sgRNA-Cas9、 DNA模板转化293T细胞，用lipofectmine2000转染试剂将上述两种质粒转染293T细胞。

4嘌呤筛选，检测荧光嘌呤筛选3-4周后，95%的HEK293细胞表达RFP(图3)。a、转染筛选后明视野图B、转染筛选后荧光图C未转染嘌呤筛选细胞。5.PCR用于检测基因组和RFP蛋白是否被敲入。为了证实RFP在基因组DNA中被敲除，设计了一对引物，引物1靶向RFP上游的5’同源臂，引物2靶向RFP-嘌呤霉素基因。

1.1kb PCR产物显示成功敲入了AAVS1位点。没有PCR扩增表明敲入不成功(图4)。

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