急求解答：气相色谱（FID）溶剂峰峰高很低 三氟乙酸紫外吸收

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一、急求解答：气相色谱（FID）溶剂峰峰高很低

一、急求解答：气相色谱（FID）溶剂峰峰高很低

修复被污染的HPLC色谱柱的关键是了解污染物的性质，然后找到合适的溶剂将其去除。如果污染物是由一些强保留物质在多次进样中的累积引起的，则通过简单的清洗过程去除这些污染物通常会恢复色谱柱的性能。有时，等度操作后，20个柱中90% ~ 100%的溶剂B(二元逆系统中较强的溶剂)会除去这些污染物。

(表2列出了各种类型HPLC色谱柱的柱体积，因此读者可以很容易地确定色谱柱的冲洗体积。例如，可以通过使用一些非水溶剂，如甲醇、乙酸乙酯和四氢呋喃来除去脂质化合物。如果使用含水的缓冲流动相，切勿将流动相直接加入强溶剂中。

突然将流动相换成高比例的有机相，会导致高效液相色谱流动系统中出现缓冲液沉淀，造成更严重的问题，如筛板堵塞、接口管道堵塞、泵垫片失效、泵柱塞杆划伤、取样阀转子失效等。而是用无缓冲的流动相洗柱(即用水代替缓冲液)。在5 ~ 10倍柱体积的无缓冲溶剂冲洗后，可以让强溶剂流过色谱柱。

有时，流动相中的强溶剂成分不能完全除去色谱柱中的污染物。必须使用更强的溶剂或一系列溶剂来清洗色谱柱。如果污染物是非生物的，用户可以通过一种或多种其他有机溶剂去除不需要的化合物。可以使用多种溶剂和溶剂组合。访问一些色谱柱制造商的网站，浏览一些推荐的溶剂系统。

一般来说，所有的清洁都会遵循类似的模式。清洗过程中溶剂浓度增加，通常最后会使用一些非极性溶剂(如乙酸乙酯，甚至碳氢化合物)，这将有助于溶解一些脂类和油类化合物。重要的是要确保该系列中的每种溶剂都与下一种使用的溶剂混溶。清洗循环的结论是，在返回初始流动相系统之前，它可以被中间互溶溶剂逆转。

例如，异丙醇是该中间步骤的优良溶剂，因为它可与有机溶剂如正己烷和二氯甲烷混溶，并且它也可与水性溶剂混溶。因为异丙醇的粘度很大，所以清洗时要保证流速不要太高，否则泵的压力会过载。

同样，如果使用紫外检测器，必须避免使用在紫外光谱区吸收的溶剂，因为需要大量的清洗溶剂来去除所有吸收的溶剂，以获得稳定的基线。不含缓冲液的典型键合硅胶色谱柱和流动相的推荐清洗系统为：

L 100%%甲醇；L 100%% b眼；L 75%%乙基眼——25%异丙醇；L 100%%异丙醇；L 100%%二氯甲烷；L 100%%正己烷；

当使用二氯甲烷或正己烷作为洗涤溶剂时，由于溶剂的不相容性，在使用含水的流动相之前，需要用异丙醇洗涤色谱柱。用于清洗色谱柱的清洗溶剂的体积至少应为色谱柱体积的10倍。对于250毫米4.6毫米的色谱柱，分析人员可以使用1 ~ 2毫升/分钟的经典HPLC流速。为了回到最初的流动相，色谱工作者可以跳过颠倒使用这一系列清洁剂。

建议使用异丙醇作为中间清洗溶剂，然后用不含缓冲液的流动相冲洗，最后用原流动相冲洗。四氢呋喃是另一种广泛使用的溶剂，可用于清洗被污染的色谱柱。如果用户怀疑色谱柱被严重污染，可以用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺与水按50: 50的比例清洗，流速小于0.5mL/min。

反相液相色谱柱的成功再生需要相当长的时间，用溶剂清洗可以为过夜操作建立梯度程序。*

清洗过程中，出现了色谱柱是否要倒洗的问题。因为大部分强截留污染物会停留在色谱柱前端，所以倒着清洗色谱柱会减少溶解污染物流出色谱柱的迁移距离。就填充层的稳定性而言，大多数现代高效液相色谱柱的填充压力远高于普通操作压力；因此，色谱柱的填充层不应受到反向流速的干扰。

但如果色谱柱顶部筛板的缝隙比底部大，这种反过来的方式是有害的。例如，如果底部筛板的间隙为2m，则足以容纳填充平均粒径为5m的色谱柱。(颗粒大小分布为5 2微米)。但厂家往往在色谱柱顶部安装孔隙率较大的筛板，以防止被样品或流动相颗粒堵塞。

如果这个筛板的孔隙率大于粒度分布中最小的颗粒，部分填料会通过筛板流出色谱柱，产生中空。如果色谱柱上有一个箭头提醒色谱柱的流向，我觉得在反向使用色谱柱之前，应该参考使用说明书，浏览厂家网站或者和技术支持组讨论，确定这是否是安全之举。

无论你是否反向使用色谱柱，最好将色谱柱与HPLC检测器断开，这样污染物或颗粒会停留在筛板上而不会流过检测池，因为这些物质会污染检测池。

清洗被污染的反相色谱柱的频率取决于柱内注入了多少未知物质，因为反相色谱柱在分辨率损失和外来物质洗脱之前，有时可以容忍大量的污染物，用户往往要等到观察到一些异常现象后才清洗色谱柱。但污染物长时间积累，会增加色谱柱清洗的难度。正因为如此，如果你知道你的色谱柱容易被脏的样品基质污染，我建议定期清洗你的色谱柱。

清洗的次数越多，清洗条件也就越简单。

反相硅胶基质色谱柱中残留蛋白质的清洗

如果一些如血浆、血清的生物物质留在了反相液相色谱柱上，色谱工作者必须使用一些不同的清洗程序。在大部分情况下，一些比较纯的有机试剂如乙睛或甲醇是不能溶解肽和蛋白质的，所以它们不能有效清洗反相液相色谱柱。然而加入了缓冲液、酸或者一些离子对试剂的混合有机溶剂能够有效清洗这些物质。起初，可以尝试含比较高浓度的溶剂B的流动相来冲洗色谱柱。

Freiser和他的同事（4）发现来回反复地梯度洗脱，使用三氟乙酸的水溶液和三氟乙酸—正丁醇可以使污染的反相液相色谱柱再生。Bhadway和Day（5）建议进样100L的三氟乙醇到250mm4.6mm色谱柱可以达到清洗的目的。如果这些方案都失败了的话，推荐使用Cunico和他的同事们（6）的强洗脱液和溶解性的试剂（见表三）。

然而，在用这些试剂冲洗色谱柱之前，应该参考色谱柱的手册，或和生产商进行商议，以确保其不会破坏色谱柱的填料。硅键合色谱柱的填料往往能够与这些试剂共存，而聚合物色谱柱可能会因为与特定溶剂结合而使填料产生膨胀或收缩，从而影响到色谱柱的性能。

表三用于HPLC反相色谱柱蛋白质物质除去的清洗溶剂

溶剂 组成

乙酸 1%的水溶液

三氟乙酸 1%的水溶液

0.1%三氟乙酸-异丙醇 40：60（V：V）（粘稠的，通常降低流速）

TEA-异丙醇 40：60（V：V）（在三乙胺混合前用0.25N的磷酸调节pH到2.5）

尿素或胍的水溶液 5-8M（调节pH到6-8）

NaCl，Na3PO4，Na2SO4水溶液 0.5-1.0M (Na3PO4 pH 7.0)

DMSO-水或DMF-水 50：50（V：V）

来自参考文献6。

如果使用了早期的一系列溶剂，则必须确保表三中的溶剂与这个系列中的溶剂都是互溶的。异丙醇是一个良好的中间冲洗溶剂。在体系中的清洗体积最少为20个柱体积。由于一些溶剂清洗系统具有一定的粘滞性，所以必须调整冲洗流速以避免产生超压。在清洗完一根含有胍和尿素的色谱柱后，需要用至少4050柱体积的色谱级的水进行冲洗。

对于反相高效液相色谱柱来说使用一些如十二烷基磺酸钠（SDS）和Triton的清洗剂来清洗是不妥的，因为这些化合物会强烈地吸附在硅胶基质的表面而难以去除。这些试剂会影响填料表层，改变填料的性质。然而，分离小组的研究发现，肽合成过程中保护基团和净化剂产物对柱子的污染，可以通过在流动相中注射500L的1SDS溶液以1mL/min的流速进行冲洗（7）。

如果接下来使用含0.1(V/V)三氟乙酸的595乙睛的梯度，在开始的条件下进行平衡，多肽的分离效果则可恢复。

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