bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响 bradford法测蛋白浓度

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一、bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响

一、bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响

Bradford法，即考马斯亮蓝法，用于测定蛋白质含量。原理是考马斯亮蓝在电离状态下呈棕红色，最大光吸收为488nm。当与蛋白质结合时，它会变成蓝色，当与色素结合时，蛋白质会吸收波长为595nm的最大光。吸收值与蛋白质含量成正比，可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质和考马斯亮蓝在2分钟左右达到平衡，反应非常迅速。粘合剂在室温下保持稳定1小时。该方法制备的试剂简单、易操作、反应灵敏度高。灵敏度比Lowry方法高4倍，可用于测定微克级的蛋白质含量。主要不利因素是特殊蛋白的结构和缓冲液中的干扰物。扩展数据：考马斯亮蓝法测定蛋白质的过程；

1、 Bradford浓染料溶液的制备：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95% 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，然后加入蒸馏水至200ml。该染料溶液在4下至少保持稳定6个月。2、标准曲线蛋白质样品的制备：尽量使用与待测样品性质相似的蛋白质作为标准，例如测定抗体，使用纯化的抗体作为标准。如果待测样品未知，抗体也可用作标准蛋白。标准曲线通常绘制在20微克和150微克/100微升之间。

3、将待测样品溶解在缓冲溶液中，缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好是PBS)。4、将浓染料结合液用蒸馏水按1: 4的比例稀释，如有沉淀则过滤除去。5、向每个样品中加入5ml稀释的染料结合溶液，持续5-30分钟。染料溶液与蛋白质结合后，会由红色变为蓝色，在595nm处测得其吸光度。注意，颜色反应不应超过30分钟。6、根据标准曲线计算待测样品的浓度。

注意：该方法对于大多数蛋白质的定量是准确的，但是它不适合于小分子碱性肽的定量。例如核糖核酸酶或溶菌酶。洗涤剂浓度超过0.2%会影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

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